МАРКЕРНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЗМІН ДИНАМІКИ СКОРОЧЕННЯ СКЕЛЕТНОГО М’ЯЗУ (MUSCULUS GASTROCNEMIUS) У ПЕРШІ ГОДИНИ ІШЕМІЧНОГО УРАЖЕННЯ

Ішемічне ушкодження м'язу серйозна клінічна проблема, яка виникає при багатьох захворюваннях (інфаркт міокарда, травми, неправильно накладені джгути, а також деякі нервово-м'язові захворювання). Тваринні моделі ішемія-реперфузія широко використовується для вивчення патофізіології та наслідки травм, а також в клітиній та генній терапії. Ішемія викликає гостре пошкодження м'язів, судинної системи, нервів часто супроводжується ушкодженням скелету з наступним послідовним розвитком дефіциту нервово-м'язової функції [1-3]. Тучні клітини, нейтрофіли, запальні цитокіни, оксид азоту та активні форми кисню, швидше за все, грають роль в остаточній диструкції, яка спостерігається в скелетному м'язі [1, 3, 4]. Повна ішемізація тривалістю більше 2 годин викликає смерть великих м'язових волокон. Так як скелетні м'язи здатні до регенерації після травми, то за вчасної реперфузії відбувається регенерація ураженої ділянки м'яза. Тим не менш, нещодавно було повідомлено, що на 14 день після чотирьохгодинної ішемізації травмованих м'язів повне відновлення функції м'язів не було досягнуто [5]. Попередні дослідження також показали, що повного відновлення м'язів після ішемієіндукуючих травм може зайняти кілька тижнів [6]. Тому важливо вивчити довгострокові відновлення м'язів після травм ІК призводить до загибелі клітин. Кілька досліджень було проведено для вивчення довгострокового відновлення м'язів після ішемізації, але, швидше за все, вони не викликали масову загибель клітин в моделях, які були використані [7, 8]. На відміну від Карваліо і співавт. [7], Фіш та співавт. [8] встановили, що повне відновлення м'язів не була досягнуте навіть через 42 дні після двогодинної ішемії, максимальна сила ще залишалася зменшеною в ішемізовано-реперфузованому м'язі у порівнянні з контрольними м’язами щурів.

З вищезазначеного випливає необхідність розробки методів максимально швидкої та ефективної діагностики початкових етапів ішемічного пошкодження м’язу, коли, за своєчасно наданої допомоги, можливе повне відновлення функціональності м’язу. На нашу думку, перспективним в плані цінності для діагностики патології є дослідження змін механічних параметрів скорочення ураженого м’язу.

Нас зацікавило питання чи є зміни в динаміці скорочення м’язу у перші години ішемізації, і якщо так, про що ми здогадувалися, чи є ці зміни маркерними, та чи можуть вони маскуватися під стандартні зміни динаміки м’язового скорочення викликані втомою.

В роботі наведені результати отримані лабораторією збудливих систем Київського Національного Університету ім. Тараса Шевченка при дослідженні ішемічного переродження скелетних м’язів, а саме розглядаючи зміну швидкісно-силових показників на штучно ішемізованих м’язах задніх кінцівках пацюків.

Експерименти, виконані на дорослих щурах масою від 0,2 до 0,3 кг. Контроль артеріального тиску вимірювали відкритим способом через канюлю, яку вводили в artery transversa colli, датчик тиску являв собою комплекс тензорезисторів.

Для ішемізації м’язів лігатурами перетягувалася стегнова артерія, що викликало регіональне припинення кровотоку і розвиток ішемічного переродженя тканин вже на 5 годині після операції. Через п’ять днів ступінь розвитку ішемії в прооперованій кінцівці дозволяв переходити до основної частини експерименту. Стандартна підготовка поряд з вище зазначеними заходами включала препарування й канюлювання (для введення фармпрепаратів і для вимірювання тиску), трахеотомію, ламінєктомію на рівні поперекового відділу спинного мозку. Препарували камбаловидний м'яз. М'яз ретельно звільняли від оточуючих тканин, його васкуляризація при цьому не порушувалась. Сухожилля м'яза перерізали та приєднанювали до механостимулятора. Для підготовки до модульованої стимуляції у сегментах L7-S, перерізали вентральні корінці безпосередньо в місця їхнього виходу зі спинного мозку. Реєстрацію сили скорочення пучків волокон скелетного м'язу здійснювали на тензометричній установці, створеній на кафедрі біофізики Київського національного університету ім. Тараса Шевченка.

В серії дослідів А (рис.1) досліджувалися зміни характеристик скорочення м’язу musculus gastrocnemius у відповідь на стимуляційний сигнал базової прямокутної форми з характеристиками: частота 30Гц, тривалість 5000 Мс, час релаксації між пробігами 1хв. В даній серії тривалість утримання лінійної частоти імпульсів (рівня 30 Гц) була 1000 Мс. Метою даної серії було з’ясування змін характеристик силової відповіді ішемізованого м’язу за різних тривалостей безперервної («тетанічної») стимуляції. В контролі, як нами і передбачалося, істотних змін, на досліджуваній часовій ділянці, не спостерігалося. На ділянках Bта C, що відповідають силовій відповіді м’яза на початку та кінці тетанічної частоти стимуляційних сигналів відповідно, зменшення сили складав 2% та 1% відповідно. До того ж збереглось співвідношення зміни сил, а саме: спад сили відповідний початку частоти тетанічної стимуляції м’язу був більший спаду сили, що відповідав закінченню частоти тетанічної стимуляції м’язу, отже B > C. В експерименті, на відміну від контролю, спад сили в часі спостерігався на протязі усього експерименту. Ділянка утримання силової відповіді, що залишалася незмінно лінійною (Р2), складала лише 14% тривалості відповідної ділянки контролю (Р1). Зменшення силина ділянці відповідній початку тетанічної стимуляції м’язу(Е) за час експерименту складав 35%, зменшення сили на ділянці відповідній закінченню тетанічної стимуляції м’язу (F) за час експерименту склав 30%. Сила спадала на протязі кожного пробігу експерименту (кожного стимуляційного сигналу) від початку силової відповіді до її закінчення. Спад наближався до лінійного після першої чверті пробігу. Порівнюючи дану серію дослідів з аналогічною в якій тривалість тетанічної стимуляції складала не 5000 Мс а 4000 Мс бачимо, що у контролях зменшення сили в ділянках відповідних початкам тетанічної стимуляції більше за зменшення сили у ділянці відповідній за закінчення тетанічної стимуляції в обох модифікаціях стимуляційних сигналів. У експерименті ми бачимо, що за збільшення часу тетанічної стимуляції до 5000 Мс падіння сили у ділянках початку (E) та закінчення (F) тетанічної стимуляції було приблизно однаково, за незначного більшого падіння у ділянці Е (Е=35% > F=30%). В той час як у випадку з тривалістю стимуляції 4000 Мс (попередній дослід) в експерименті була чітка диверсифікація процесів зменшення сили які були набагато більш виражені в кінці утримання тетанічного рівня стимуляції.

Отже зі збільшенням тривалості стимуляції тетанічним рівнем сигналу з 4000 Мс(досліджувалася в попередніх експериментах) до 5000 Мс спостерігається загальне пришвидшення розвитку процесів втоми, яка починає розповсюджуватися з другої половини скорочення до першої і охоплює усю ділянку тетанусу. Ділянка лінійного утримання тетанічного рівня сили (Р2) відносно загальної тривалості тетанічного рівня сили (Р1) не змінилася і продовжує складати приблизно 14%.

В серії дослідів Б (рис.2) досліджувалися зміни характеристик скорочення м’язу musculus gastrocnemius у відповідь на стимуляційний сигнал базової пірамідальної форми з характеристиками: час лінійного наростання частоти 2000 Мс, час лінійного спаду частоти 2000 Мс, max частота 30Гц. (Дана стимуляція використовується для дослідження нелінійних особливостей динаміки м’язового скорочення). За тривалості експерименту 30 хвилин, силова відповідь нативного м’язу майже не зазнала змін. Перша (В1) третина ділянки силової відповіді, відповідної лінійному збільшенню частоти стимуляції, та остання третина (В3) силової відповіді м’язу, відповідної лінійному зменшенню частоти стимуляції мали чітко виражений тремор кривих. Значення сили м’язу утримувалося лінійно, в контролі на протязі усіх пробігів, протягом 1000 Мс на ділянці, відповідній в часі ділянці, що обабіч охоплює максимальну частоту стимуляційного сигналу. В ішемізованому м’язі спостерігалися зміни силових кривих, по відношенню до контролю, на усьому протязі експерименту. На фазі лінійного збільшення частоти стимуляції спостерігається збільшення ділянки тремора кривих, від 52% (В1) у контролі до 100% (А1) в експерименті. На ділянці G експерименту поряд з тремором спостерігається поступове зменшення сили на протязі експерименту, в той час як на відповідній частині ділянки А 1 контролю, сила залишається майже незмінною, треба зазначити, що на ділянці В1 експерименту зменшення сили не спостерігалося. Загальна кількість стрибків сили на фазі лінійного збільшення частоти стимуляції в експерименті (D1) більша за їх кількість у контролі (С1) на 67%. В той час як кількість стрибків сили на фазі лінійного збільшення частоти стимуляції, за час тривалості тремору в контролі (С1) на 9% менша в порівнянні з відповідною ділянкою в експерименті (С2). На ділянках лінійного зменшення частоти стимуляції як і на ділянках лінійного збільшення частоти стимуляції в експерименті спостерігалася значне подовження фази тремору силових кривих, по відношенню до контролю, особливо помітне на кривих, що відображають швидкість зміни сили. Тривалість фази стрибків в контролі (Е1) була на 71% менша відповідної фази в експерименті (F1). В той час як кількість стрибків сили на фазі лінійного зменшення частоти стимуляції, за час тривалості тремору в контролі (Е1) на 7% менша в порівнянні з відповідною ділянкою в експерименті (Е2). Поряд із тим в експерименті спостерігалася значне зменшення сили у часі в порівнянні з контролем, та збільшення кута нахилу кривої зміни сили ішемізованого м’язу. Зменшення сили не зачепили ділянку B3.

Отже за пірамідальної стимуляції тривалістю 4000 Мс, з поступовим лінійним збільшенням частоти стимуляційних сигналів до 30 Гц за 2000 Мс, та подальшим, без попереднього утримання частоти, лінійного зменшення частоти стимуляційних сигналів до 0 Гц за 2000 Мс, спостерігалися значні зміни динаміки м’язового скорочення в експерименті, в той час як в контролі вони були майже відсутні. Значно зросли в часі ділянки тремори кривих сили на початку та кінці стимуляції. Фаза лінійного утримання сили майже зникла. Сила зменшувалася за час експерименту на протязі усіх пробігів, за виключенням крайніх ділянок кривих.

Підсумовуючи вище наведені результати експериментів, можна стверджувати:

1. Вже в продовж перших годин ішемічного ураження скелетного м’язу, спостерігається зміни в динаміці процесу скорочення.

2. Зміни в динаміці скорочення ішемізованого м’язу значно відрізняються від змін викликаних втомою.

3. Особливості змін динаміки скорочення ішемізованого м’язу можна використовувати для діагностування патології вже в перші години патогенезу.

Література:

1. Gute D. C., Ishida T., Yarimizu K., Korthuis R. J.Inflammatory responses to ischemia and reperfusion in skeletal muscle// Molecular and Cellular Biochemistry. - 1998. - Vol. 179.- № 1-2 - Р. 169-187.

2. Pipinos I., Judge A. R., Selsby J. T., et al. The myopathy of peripheral arterial occlusive disease. Part 2. Oxidative stress, neuropathy, and shift in muscle fiber type// Vascular and Endovascular Surgery. - 2008. - Vol. 42.- № 2 - Р. 101-102.

3. Pipinos I., Swanson S. A., Zhu Z., et al. Chronically ischemic mouse skeletal muscle exhibits myopathy in association with mitochondrial dysfunction and oxidative damage. American Journal of Physiology. - 2008. - Vol. 295, - № 1, P. R290-R296.

4. T. V. Arumugam, I. A. Shiels, T. M. Woodruff, D. N. Granger, and S. M. Taylor, “The role of the complement system in ischemia-reperfusion injury// Shock. - 2004, - Vol. 21, №. 5, P. 401–409.

5. Walters T. J., Kragh J. F., Kauvar D. S., Baer D. G. The combined influence of hemorrhage and tourniquet application on the recovery of muscle function in rats// Journal of Orthopaedic Trauma. - 2008, - Vol. 22, №. 1, P. 47-51.

6. Vignaud J., Caruelle P., Martelly I., Ferry A. Differential effects of post-natal development, animal strain and long term recovery on the restoration of neuromuscular function after neuromyotoxic injury in rat// Comparative Biochemistry and Physiology. -2006, - Vol. 143, №. 1, P. 1-8.

7. Carvalho J., Hollett P., McKee N. H. Recovery of synergistic skeletal muscle function following ischemia// Journal of Surgical Research. - 1995, - Vol. 59, №. 5, P. 527-533.

8. Fish J. S., McKee N. E., Kuzon W. M., Plyley M. J. The effect of hypothermia on changes in isometric contractile function in skeletal muscle after tourniquet ischemia// Journal of Hand Surgery. - 1993, Vol. 18, №. 2, P. 210-217.

Науковий керівник:

Академік АН ВШ України, доктор біологічних наук, професор Мірошниченко Микола Степанович