ЭКСПРЕСС- МЕТОД ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ВОДНЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПОЛЛЮТАНТОВ.

Возрастание масштабов загрязнения водных экологических систем поллютантами различной природы и накопление их во внешней среде обусловливают необходимость разработки новых чувствительных и доступных методов оценки функционального состояния фотосинтезирующих организмов - первого звена трофической цепи.

При работе с микроорганизмами важное значение имеет не только определение темпов их роста и размножения, но и умение диагностировать состояние и степень жизнеспособности. Одним из важнейших элементов этой диагностики может быть определение соотношения живых и мертвых клеток, поскольку в культурах водорослей, находящихся даже на стадиях активного роста и размножения, всегда имеется определенный процент мертвых клеток. Численность последних особенно увеличивается при попадании водорослей в экстремальные условия [1, с.143].

Не менее интересную информацию о состоянии жизнеспособности культуры может дать изменение рН среды: чем выше жизнеспособность водорослей, тем значительнее изменяется на свету реакция среды - происходит ее подщелачивание в результате фотосинтетической ассимиляции карбонатов. При применении токсических веществ, ослабляющих интенсивно протекающий процесс фотосинтеза или влияющих на количественное содержание хлорофиллов в клетках водорослей, происходит снижение потребления углекислоты и подкисление питательного раствора [2, с.7]. Многообразие причин изменения рН в культурах и суспензиях целых клеток позволяет говорить о величине рН как об универсальном физиологическом показателе. Интенсивность фотосинтеза является одним из главных интегральных показателей состояния микроводорослей, так как отражает наиболее важную сторону метаболизма – способность клеток к генерации энергии, синтезу АТФ. Кроме того, нарушение фотосинтетической активности является более чувствительной реакцией одноклеточных водорослей на токсические воздействия, чем снижение скорости роста численности клеток или изменение содержания пигментов.

По изменению рН среды можно не только качественно охарактеризовать интенсивность фотосинтеза водных растений. Зная изменения активной реакции воды, можно рассчитать эквивалентные им количества ассимилированной углекислоты. Основанный на этом принципе вариант метода склянок с 1951 года применялся в США на оз. Эри. Изменения рН среды определяют либо колориметрическим методом, либо с помощью стеклянного электрода. Еще в 1938 году Блинкс и Скау использовали стеклянный электрод, находящийся в непосредственном контакте с фотосинтезирующим листом водяной лилии Castalia и с клетками водорослей, осажденными из суспензии. Им удалось также зарегистрировать у морской водоросли Stephanoptera быстрые изменения рН, возникающие при вспышках продолжительностью всего 0,02 сек. Наименьший воспроизводимый ответ соответствовал изменению рН на 0,001 единицы. Взаимосвязи между рН и CO₂ были использованы во многих работах, однако часто не учитывались некоторые стороны этих взаимодействий: зависимость рН среды от содержания CO₂ в ней не линейна, а степень изменения рН за единицу времени изменения CO₂ зависит от буферной емкости воды.

Метод определения интенсивности фотосинтеза по количеству СO₂ в среде, найденному по значению рН, применялся для изучения чистого фотосинтеза и ночного дыхания в лабораторных микроэкосистемах. Для измерения продукции пресноводных макрофитов рН-СO₂ метод применялся крайне редко. В токсикологических исследованиях использовался метод титрации культуральной среды для определения меры воздействия альгицидных препаратов на планктонные водоросли [1, с.148 ].

Следует отметить, что метод определения функционального состояния водных растений по изменению рН среды не нашел широкого применения в лабораторных исследованиях, хотя ценность данного физиологического показателя в связи с присущим ему сохранением интактности делает его использование необходимым дополнением при проведении любых токсикологических экспериментов.

Анализ данных литературы показывает, что при изучении токсичности металлов (как одного из наиболее опасных классов загрязнителей) для оценки реакции водорослей и высших водных растений на их воздействие чаще всего используются такие показатели, как рост численности, интенсивность фотосинтеза, количественный и качественный состав пигментов и др. Большинство исследователей для определения одного из важнейших показателей – интенсивности фотосинтеза – используют радиоуглеродный и кислородный методы.

Однако при проведении экспериментов часто необходимо производить непрерывную запись показателей, что можно сделать, например, определяя фотосинтетическую активность по изменению активной реакции водной среды. К сожалению, данный способ не практикуется в токсикологических опытах, хотя доказано, что в определенных условиях изменения рН среды инкубации могут служить показателями энергетических реакций дыхания и фотосинтеза. По-видимому, исследователи не пользуются этим методом из-за его неразработанности для токсикологических экспериментов. На наш взгляд, такой метод мог бы широко использоваться для экспресс-анализа функционального состояния фотосинтезирующих организмов в условиях действия повреждающих факторов, конечно, в виде, модифицированном по отношению к описанным ранее способам определения первичной продукции. Это и побудило нас подробно исследовать закономерности изменения рН среды в культуре микроводорослей в норме и при воздействии токсикантов.

Показатель рН среды измерялся электрометрическим методом. Изотоп С¹⁴ добавляли в склянки в виде раствора карбоната натрия NaH¹⁴CO_3. После окончания экспозиции содержимое склянок отфильтровывалось через мембранные фильтры "Сынпор" N5 с диаметром пор 0,6 мкм. Дальнейшая обработка фильтров проводилась стандартным способом. Определение активности фильтров проводилось методом жидкостной сцинтилляции.

При культивировании водорослей в отсутствие продува и протока, в частности, при длительном стерильном ведении культуры, рН среды быстро и заметно сдвигается в щелочную зону, достигая за несколько дней некоторого стационарного значения. В первые дни развития культуры, до выхода величины рН на плато, интенсивность фотосинтеза водорослей, по-видимому, может быть оценена по скорости сдвига рН среды. При установлении стационарного уровня, который, как показали опыты, например, в культуре Chlorella pyrenoidosa достигает 9,0 – 10,0 единиц рН и поддерживается более двух недель, значение рН среды становится основным фактором, регулирующим уровень фотосинтеза: в щелочной зоне клетки переходят на бикарбонатное питание, которое энергетически менее выгодно, поскольку в цикле Кальвина фиксируется лишь CO₂, а ион ОН^- должен быть выведен из клетки. Подсчитано, что в среде с рН 11,0 для выведения 1 моль ОН^- расходуется 1 моль АТФ. Поэтому после установления стационарного уровня рН увеличение числа фотосинтезирующих клеток возможно только за счет снижения интенсивности фотосинтеза каждой клетки, то есть интенсивность фотосинтеза каждой клетки становится обратно пропорциональной плотности культуры. Снижение интенсивности фотосинтеза связано не только с увеличением рН, но и с ухудшением состояния культуры, ее старением, однако потенциальные возможности клетки к фотосинтезу могут оставаться достаточно высокими и могут быть использованы как показатели функционального состояния культуры.

Многочисленные измерения рН среды культивирования водорослей с различными интервалами времени показали, что в течение первых нескольких дней происходит быстрое постоянное увеличение рН, достигающее значения, равного 9-10 единицам. На 5 день культивирования указанный показатель в контроле достигает значения рН ~10 и удерживается в течение 2-х недель, затем среда начинает подкисляться, что, по-видимому, связано со старением культуры. При добавлении к культуре CdCl₂ в концентрации 100,0 мг/л, вызывающей гибель культуры, рН среды изменяется мало. При воздействии менее токсичной концентрации (10,0 мг/л) происходит рост рН, однако в меньшей степени, чем в контроле и при действии более слабых растворов токсикантов [3, с.97; 4, с. 88]. Известно, что в щелочной зоне рН резко снижается включение ¹⁴С, то есть подавляются реакции фотосинтеза. Как следует из полученных данных, способность культуры увеличивать рН среды также снижается при достижении высоких его значений. Уменьшение продукции из расчета на одну клетку, как это наблюдается в культуре микроводорослей после нескольких дней ее культивирования, по-видимому, связано с моментом установления максимального значения рН. Наши данные с меткой ¹⁴С подтверждают такое предположение, а это означает, что измеренные в подобных культурах величины продукции заведомо будут заниженными. Из этого следует, что при культивировании водорослей без продува возрастает роль рН и его ингибирующее действие на физиологическое состояние культуры. Одним из способов улучшения состояния культуры и увеличения ее чувствительности к повреждающим агентам (что необходимо при проведении токсикологических экспериментов) является периодическое подкисление среды [5, 33].

Наличие обратной зависимости между плотностью культуры и способностью отдельной клетки влиять на рН среды дает основание предположить, что уменьшение плотности культуры при отравлении позволяет усилить интенсивность фотосинтеза каждой отдельной клетки и выжить в стрессовых условиях, что может рассматриваться как адаптивная реакция микроводорослей на воздействие токсикантов.

Определение интенсивности фотосинтеза по изменению рН культуральной среды достаточно хорошо характеризует направленность изменений фотосинтетических процессов в культуре микроводорослей. Таким образом, на основании полученных результатов установлено следующее:

– в непроточной культуре Chl. pyrenoidosa в фазе экспоненциального роста происходит быстрое увеличение рН среды, связанное с активацией процесса фотосинтеза в клетках;

– по достижении стационарного уровня рН высокая щелочность среды становится одним из важных факторов, угнетающих реакции фотосинтеза и ухудшающих состояние культуры в целом;

– интенсивность фотосинтеза в расчете на единицу плотности падает с увеличением плотности культуры и ее старением;

– при искусственном доведении рН культуральной среды до нормы (при подкислении среды) чувствительность культуры к ядам увеличивается;

– метод определения фотосинтетической активности водорослей по изменению рН среды позволяет достаточно просто оценивать и сравнивать интенсивность фотосинтетических процессов в токсикологическом эксперименте и производить непрерывную запись показателей.

Таким образом, определение одного из важнейших показателей функционального состояния зеленых водорослей и высших водных растений – интенсивности фотосинтеза вполне можно проводить по ∆рН культуральной среды, что значительно упрощает экспериментальную работу [3, с.97]. Опыты по оценке влияния ионов тяжелых металлов (кадмия, цинка, кобальта), детергентов и нефти на фотосинтетическую активность водорослей Sc. quadricauda и Chl. pyrenoidosa и высших водных растений Elodea сanadensis в культуре по изменению рН среды дают основание предполагать универсальность вышеуказанного подхода при диагностике повреждения водных растений токсикантами различной природы.

Литература:

1. Сиренко Л.А./Л.А.Сиренко. Эвтрофирование континентальных водоемов и некоторые задачи по его контролю. // Научные основы контроля качества вод по гидробиологическим показателям. – Л.: Гидрометеоиздат, 1981. – С.137-153.

2. Горюнова С.В./ С.В.Горюнова, С.Ф. Пономаренко. Использование зеленых водорослей для индикации токсического действия тяжелых металлов. //Тезисы докл. конф. «Актуальные проблемы комплексного изучения природы и хозяйств южных районов Узбекистана». – Карши УзССР, 1991. – С.7.

3. Горюнова С.В./С.В.Горюнова. Фотоиндуцируемое изменение рН среды как интегральный метод контроля природных и сточных вод. // Материалы международной конф. «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах». – М.: МГУ, 27-29 мая 2002. – С. 97.

4. Плеханов С.Е./ С.Е.Плеханов, Ф.Х. Пиментел, С.В.Горюнова, Ю.К. Чемерис. Ранняя диагностика токсического действия тяжелых металлов на зеленые микроводоросли по их фотосинтетическим характеристикам. // «Водные экосистемы и организмы-6» Матер. междун. науч. конф. МГУ. – М.: МАКС Пресс, 2004. – С. 87-88.

5. Горюнова С.В./ С.В.Горюнова, И.А.Воробьева. Применение метода рН-метрии для определения физиологического состояния культуры Chlorella pyrenoidosa. // Тез. докл. МОИП: зоология и ботаника (I полугодие 1979 г.). Изд. МГУ, 1979. – С.33-34.