ІДЕНТИФІКАЦІЯ мікотоксинів методом високоефективної рідинної хроматографії

Мікотоксини (від грец. μύκης, mykes, mukos - «гриб»; τοξικόν, toxikon - «отрута») - токсичні продукти життєдіяльності мікроскопічних (цвілевих) грибів. Відомо більше 250 видів грибів, які виробляють декілька сотень мікотоксинів. Багато з них мають мутагенні (зокрема канцерогенні) властивості. Серед мікотоксинів, небезпечних для здоров'я людини і тварин є поширені афлатоксини (формула I і II), тріхотецени (III-IV), охратоксини (V), патулін (VI), зеараленон і зеараленол (VII). Більшість мікотоксинів - кристалічні речовини, термічно стабільні, добре розчинні в органічних розчинниках [1, с.16]. Мікотоксини (крім охратоксину) достатньо стійкі до дії кислот, руйнуються лугами з утворенням нетоксичних або малотоксичних з'єднань.

У ряді країн Африки та Азії, де спостерігаються гострі афлатоксікози у людей, виявлена ​​пряма кореляція між частотою захворювання населення на рак печінки і вмістом афлатоксинів у харчових продуктах [2, с.13]. Хімічна детоксикація кормів аміаком при підвищеному тиску і температурі (США, Франція) або пероксидом водню (Індія) дозволяє знизити вміст афлатоксинів до безпечного рівня. Однак, при цьому втрачається частина поживної цінності корму. Перспективна біологічна детоксикація афлатоксинів та інших мікотоксинів деякими видами мікроорганізмів. При вживанні тваринами кормів, забруднених афлатоксином В1, з молоком виділяється високотоксичний афлатоксин M1 [3, с.25].

Вміст мікотоксинів у харчових продуктах та кормах варіює в широких межах і може досягати сотень мкг/кг. Оптимальна температура токсінообразованія лежить в межах від 8-12 °С (токсин Т-2) до 27-30 °С (афлатоксини). Для основних мікотоксинів у ряді країн встановлено ГДК. У харчових продуктах ГДК афлатоксину B1 0,005 мг/кг, патуліну 0,05 мг/кг, токсину Т-2 0,1 мг/кг, дезоксиніваленолу 0,5 мг/кг та 1,0 мг/кг (в залежності від виду продукту), зеараленону 1,0 мг/кг [4, с.19]. Продуценти афлатоксинів вражають головним чином зернові, олійні та бобові культури; продуценти охратоксину, зеараленону, тріхотеценов типів А і В - зернові; тріхотеценов типу С - грубі корми, багаті клітковиною; продуценти патуліну - фрукти, овочі та продукти їх переробки. Щорічні втрати сільськогосподарської продукції у світі, пов'язані із забрудненням їх мікотоксинами, перевищують 15 млрд. дол. (1985). Потенційна небезпека забруднення мікотоксинами існує для 1 млрд. т сільськогосподарської продукції.

Широкодоступного методи визначення токсичності базуються на сумнівних індикаторах, за допомогою яких виявити невеликі концентрації мікотоксинів у харчових продуктах практично неможливо. Тому такі методи часто створюють плутанину і неправильне уявлення про концентраціях мікотоксинів в харчових продуктах.

На жаль, результати таких простих методів нічого не говорять про природу токсичності. Для аналізу основних мікотоксинів існують і активно удосконалюються в останні роки досить точні кількісні методи. Одним з таких методів є імуноферментний експрес-метод. Однак він ефективний лише в тому випадку, якщо відібрані зразки адекватні складом всього харчового продукту. Проблема в тому, що мікотоксини, звичайно, вкрай нерівномірно розподіляються в харчовому продукті, наприклад в зерні або комбікормі. У місцях зростання цвілі концентрація мікотоксинів може бути дуже високою. Навіть найсучасніший метод аналізу не виявить токсичність, якщо не буде дотримана трудомістка рутинна процедура відбору проб. Тобто, якщо фахівець визнає, що зразок в 5 кг, відібраний з одного місця, досить повно відображає якість партії продукту, аналіз мікотоксинів виявиться простою тратою грошей і часу. З партії в 100 т рекомендується відібрати 30 кг продукту. Далі має бути розподіл на три рівні частини (по 10 кг), частини повинні бути тонко змолоти і знову ретельно перемішані. Тільки після цього можна брати зразки для лабораторного аналізу, зазвичай масою 50-200 г. Інструкція вимагає, щоб для офіційного аналізу зразок містив щонайменше 100 000 часток, для звичайного аналізу достатньо 50 000 часток.

Найбільш точна аналітична техніка може дати хибне уявлення про якість продукту, якщо не буде застосована схема підготовки зразка.

Одним з найбільш точних сучасних методів виявлення мізерних концентрацій мікотоксинів є метод високоефективної рідинної хроматографії.

Переваги методу:

1) метод ВЕРХ дає достовірні кількісні результати аналізу;

2) висока чутливість дозволяє зменшити витрати на пробопідготовку;

3) конфігурацію хроматографу можна швидко перебудувати для виконання інших аналізів.

Переваги хроматографу:

1) висока стабільність і точність підтримки витрати елюента забезпечується конструкцією насосів високого тиску;

2) простий доступ до колонок забезпечується конструкцією приладу;

3) ефективність розділення забезпечується застосуванням високоефективних хроматографічних колонок;

4) широкий лінійний діапазон вимірювального сигналу детекторів дозволяє з високою точністю вимірювати піки як великих, так і малих концентрацій;

5) високопродуктивна обробка хроматографічної інформації програмою, яка працює під управлінням середовища Windows.

Розглянемо визначення масової концентрації афлатоксину В1 (рис. 1,) у харчових продуктах за допомогою методу високоефективної рідинної хроматографії.

Принцип вимірювання полягає в екстракції афлатоксину В1 з продуктів органічним розчинником, очищення екстракту за допомогою твердофазної екстракції та визначенні масової концентрації афлатоксину В1 методом високоефективної рідинної хроматографії, із застосуванням флуоресцентного детектора. Зміст афлатоксину розраховується за допомогою градуювальної залежності, площі хроматографічного піку афлатоксину від змісту афлатоксину у пробі. Кількісне визначення масової концентрації афлатоксину проводять методом зовнішнього стандарту з попереднім калібруванням хроматографу за стандартними розчинами [5, с. 6].

Конфігурація високоефективного рідинного хроматографу "PerkinElmer Series 200a": дегазатор, Автосамплер, насос квадро, термостат колонок, флуоресцентний детектор.

Задана конфігурація та режим роботи:

колонка: 150 x 4,6 мм

нерухома фаза: Peco HCODS-C18, 5 мкм

температура колонки: 30 С°

довжина хвилі збудження: 365 нм

довжина хвилі емісії: 455 нм

об'єм проби: 50 мм³

режим введення проби: автоматичний

витрата елюенту: 1,0 см³/хв

елюент А: Н2О (очищена системою "Millipore")

елюент В: СН₃ОН (для ВЕРХ)

елюент С: СН_ЗCN (для ВЕРХ)

режим елюювання: ізократичний

При використанні хроматографу або колонки іншого типу, умови проведення аналізу, порядок виходу компонентів та відносний час утримування можуть бути іншими.

Умови виконання вимірювань підлягають перевірці та при необхідності коригуванню:

- При переході на інший хроматограф;

- При заміні колонок;

- Після ремонту вузлів хроматографу, що впливають на чутливість детектора.

Хроматограф градуюють за стандартними розчинами компонентів.

Рис. 1. Хроматограма афлатоксину В1 з концентрацією рівною 0,0165 мг/дм³, отримана з використанням флуоресцентного детектору

Висновок

В цілому питання безпеки продуктів харчування містять у собі досить широкий спектр проблем, які в останні десятиліття у світовій пресі, в тому числі наукових та науково-популярних виданнях, обговорюються досить часто [6, с. 89]. Дослідження в цій області останнім часом, у зв'язку з погіршенням екологічної ситуації, проводять у широких масштабах, та ці дослідження мають системний підхід.

Основними шляхами вирішення цієї актуальної проблеми є:

- Перегляд нормативної документації, що регламентує критерії та методи оцінки якості, безпеки харчової продукції та продовольчої сировини;

- Введення додаткових показників, прийнятих у нормативній документації (визначення ряду антибіотиків та інших лікарських препаратів, стільбенов, стероїдних гормонів, бета-антогонистов, тиреостатиків і т.д.);

- Розробка прискорених методів аналізу, прийнятних для широкого практичного застосування. З економічної точки зору необхідно створення вітчизняних тест-наборів, тест-систем та вимірювальної апаратури, які дешевше імпортних та доступні для випробувальних лабораторій;

- Поступовий перехід контролю готової продукції до попереднього контролю на стадії її виробництва, дозволяє істотно знизити витрати на проведення досліджень, прогнозувати якість та безпеку продовольчої сировини харчової продукції;

- Розробка системи екологічного регіонального моніторингу об'єктів навколишнього середовища (грунти, води, повітря), які безпосередньо впливають на якість та безпеку сільськогосподарської продукції;

- Планування і відповідна координація тематик науково-дослідних установ з урахуванням пріоритету розробок в області методичного забезпечення оцінки якості та безпеки продовольчої сировини харчової продукції.

Таким чином, у даний час стратегію безпеки продуктів харчування визначають превентивні заходи від забруднення та зараження, як хімічного, так і біологічного характеру на всіх стадіях та ступенях виробничого ланцюга харчової продукції.

Література:

1. Шустов С.Б., Шустова Л.В. Химия и экология. - Нижний Новгород: Нижегородский гуманитарный центр, 1994. - 239 с.

2. Тутельян В.А., Кравченко Л.В., Микотоксины. - АМН СРСР. - М.: Медицина, 1985. - 211 с.

3. Смирнов В.В., Зайченко Ф.М., Рубежняк І.Г., Мікотоксини: Фундаментальні і прикладні аспекти. // Сучасні проблеми токсикології - 2000. - №1. - 5 - 12 с.

4. Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов, М.: 1990 - 185 с.

5. Запталов Б.Й., Максін В.І., Ващенко В.В. Методика виконання вимірювань масової частки афлатоксину В1 у харчових продуктах та сировині методом високоефективної рідинної хроматографії, - К.: Український державний науково-дослідний інститут „Ресурс”, 2012. - 12 с.

6. Cheeke P.R. Mycotoxins in cereal grains and supplements. In: Natural Toxicants in Feeds, Forages and Poisonous Plants. Interstate Publishing Inc., Danville, IL, USA, 1998, pp. 87 - 136.

Науковий керівник:

доктор хімічних наук, професор, Максін Віктор Іванович.