АНТИБАКТЕРІАЛЬНА АКТИВНІСТЬ СПИРТОВИХ ЕКСТРАКТІВ КВІТІВ ЩОДО ТЕСТ-КУЛЬТУРИ BACILLUS SUBTILIS УКМ B-90

Починаючи з 2006 року популяція бджіл у Сполучених Штатах та Європі стрімко скорочується. Це явище вперше з’явилося під назвою "Хвороба осіннього зникнення», але було перейменоване у «Синдром зруйнованих колоній» (СЗК) (від англ. Colony collapse disorder, CCD) і має на увазі раптове зникнення бджолиних родин [1, 2].

За попередніми даними, упродовж кожної зими втрати в США сягають до 30% бджолиних сімей. Це явище спостерігається в багатьох країнах Європи: у Бельгії, Франції, Нідерландах, Греції, Італії, Португалії, Іспанії, Швейцарії та Німеччині. У цілому в Європі кожен рік втрачається більше 20% бджолиних сімей, аналогічна тенденція починає простежуватися в Латинській Америці і в Азії. В останні роки повідомляють про випадки «зникнення» колоній бджіл в Росії та в Україні [3, 4].

Зникнення бджіл з нашої планети може посилити продовольчу кризу. За рахунок запилення комахами плодоносять культури, які дають третину від усього обсягу продовольчих ресурсів людства, при цьому 80-90% запилення виконується саме бджолами. Ці культури забезпечують 35% від загальної кількості калорій, що надходять до нашого організму, а також більшість мінералів, вітамінів, антиоксидантів [5, 6].

Синдрому зруйнованих колоній притаманні певні «симптоми»: швидка втрата дорослих робочих бджіл; наявність малої кількості загиблих бджіл у вулику або повна їх відсутність; присутність незрілих бджіл (розплід) та невеликої групи бджіл з живою королевою; наявність у стільниках пилку і меду. Серед основних симптомів CЗК є раптове зникнення дорослих особин без накопичення великої кількості мертвих бджіл. Бджоли не повертаються у вулик, але залишають свій виводок (молодих бджіл), їх королеву, і, можливо, невелике скупчення дорослих особин. Для бджіл така поведінка не є характерною, адже вони є соціальними комахами, зі складною і організованою структурою колонії. Відсутність великої кількість мертвих бджіл робить аналіз причин СЗК важким. Також немає ніяких ознак того, що вулик міг бути атакований паразитами [2, 3].

Науковці зосередились на основних чинниках, що можуть викликати «Синдром зруйнованих колоній»: екологічні процеси; чинники, пов’язані з харчуванням; бактерії; віруси; паразити [1, 2, 7, 8, 9, 10].

Серед негативних чинників, що можуть викликати загибель бджіл - міжвидова конкуренція між місцевими та інтродукованими бджолами, зміна середовища проживання бджіл, генетичні хвороби комах, стільниковий зв’язок, випромінювання від ліній електропередач.

Вчені Французького національного аграрного інституту припускають, що масова загибель бджіл може бути пов'язана зі знищенням різнотрав'я і його заміною монокультурами. Це призводить не лише до інвазії нових видів рослин з низькою продуктивністю нектару і пилку, а й до зникнення чи суттєвого зменшення кількості рослин-медоносів, що можуть містити в складі нектару та пилку квітів речовини з антибактеріальними, антивірусними, антифунгальними властивостями і таким чином сприяти «самовиліковуванню» бджіл [11].

У вересні 2007 року були опублікуванні результати генетичного скринінгу постраждалих від «Синдрому зруйнованих колоній» бджолиних сімей. Єдиним збудником, який виявили майже у всіх зразках (96,1%) постраждалих колоній був ізраїльський вірус гострого паралічу (Israeli acute paralysis virus - IAPV, dicistrovirus), який може передаватися кліщем Varroa. Міністерство сільського господарства США вважає, що IAPV можна використовувати в якості маркера СЗК, але не як причину його виникнення [12]. Адже інші дослідження вказують на високий рівень в кишечнику загиблих комахах не лише вірусів, але й бактерій та грибів, які теж можуть бути причиною виникнення СЗК [1, 2, 7, 8, 12].

Серед збудників бактеріальних захворювань бджіл найбільш небезпечним є американський гнилець (злоякісний гнилець) - інфекційне захворювання бджолиних сімей, що супроводжується загибеллю дорослих личинок і передлялечок. У заражених стільниках спори залишаються вірулентними протягом 35 років, на вуликах і в вощині - 20, в медогінці - 5років. Збудником цього захворювання є Paenibacillus larvae (Bacillus larvae). Представники родів Bacillus та Paenibacillus є збудниками й інших бактеріальних хвороб бджіл: європейського гнильцю (Paenibacillus alvei (Bacillus alvei); Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus = Bacillus orpheus); Paenibacillus apiarius (Bacillus apiarius); парагнильцю (Васillus paraalvei), порошкоподібного розплоду (Paenibacillus larvae pulvifaciens) [13].

Відомо, що за деяких бактеріальних хвороб для бджіл властиве явище «самовиліковування», що може бути пов'язане з лікувальними та профілактичними властивостями медоносної флори. Для профілактики та лікування захворювань рекомендується поміщати вулики з бджолами в місцях з різнотрав’ям квітучих рослин [14].

Метою нашої роботи було дослідження антибактеріальної активності екстрактів квітів дикорослих та культурних рослин щодо тест-культури Bacillus subtilis.

Як тест-культуру застосовували Bacillus subtilis УКМ В-90, отриману з музею кафедри мікробіології та загальної імунології ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Культуру зберігали за температури +4^оС на середовищі м'ясо-пептонний агар (МПА) під шаром вазелінової олії. Для досліджень застосовували добову культуру мікроорганізму.

Об'єктом досліджень були спиртові екстракти квітів 135 видів рослин, з них 10 – городніх рослин, 56 – декоративних рослин, 69 – дикорослих рослин, зібраних у червні-жовтні 2012-2013 року в різних регіонах України. Спиртові екстракти квітів готували за наступною методикою: до 1 г квітів додавали 2 мл 96% етилового спирту і ретельно гомогенізували. Отримані спиртові екстракти наносили на паперові диски діаметром 6 мм. В якості контролю використовували паперові диски, оброблені сумішшю фізіологічного розчину зі спиртом (1:2). Дослідні та контрольні диски висушували в ламінарному боксі за кімнатної температури. З добової культури Bacillus subtilis УКМ В-90 готували суспензію на стерильному фізіологічному розчині за стандартом мутності 5 одиниць, 1-2 краплі бактеріальної суспензії висівали газоном на поверхню чашки Петрі з середовищем Мюллера-Хінтона (середовище для визначення чутливості до антибіотиків). Диски з екстрактами розкладали по поверхні середовища з культурою, культивували 24 год в термостаті за 37^оС, після чого реєстрували зони затримки росту мікроорганізмів.

Показано, що екстракти 38 видів рослин проявляли антибактеріальну активність щодо тест-культури, зони затримки росту становили 7-21 мм. Найбільш активними виявилися екстракти квітів цибулі ріпчастої (Allium cepa) – діаметр зони затримки росту 21 мм, жовтушника лакфiолевидного (Erýsimum cheiranthoídes) - 17 мм, ехінацеї пурпурової (Ehinacea purpurea) - 16 мм, горошку мишачого (Vicia cracca) - 16 мм. Досить високу активність проявили також екстракти квітів осоту польового (Scopcirsium arvense), вербозілля лучного (Lysimachia nummularia), гортензiї великолистої (Hydrangea macrophylla), звіробою звичайного (Hypericum perforatum), квасениці прямостоячої (Oxalis stricta), злинки канадської (Erigeron canadensis), пижма звичайного (Tanacetum vulgare), плетухи звичайної (Calystegia sepium), троянди дамаської (Rosa damascene), ромашки без'язичкової (Matricaria discoidea), скерди колосовидної (Crepis capillaris), спiреї японської (Spiraea japonica), cуріпиці звичайної (Barbaréa vulgáris), дереві́ю звичайного (Achillea millefolium), чини лучної (Láthyrus praténsis), чистотілу великого (Chelidónium május), рицини звичайної (Ricinus comminis), флокса багаторічного (Phlox paniculata), цинії витонченої (Zinnia elegans), герані садової (Pelargonium zonale), м’яти перцевої (Mentha piperita), гайлардії гостролистої (Gaillardia aristata) (рис.1).

Виявлено, що антибактеріальну активність проявляли 10% усіх досліджених городніх культур; 27% декоративних культур та дерев, 32% від усіх досліджених дикорослих культур. Середнє значення зони затримки росту для городніх культур становило 21 мм, декоративних – 12 мм, дикорослих – 11 мм. Цікавим є той факт, що деякі з рослин (м’ята перцева (Mentha piperita), липа дрібнолиста (Tília cordáta), волошка лучна (Centaurea jacea), вербозілля лучне (Lysimachia nummularia), екстракти квітів яких проявили антибактеріальні властивості що до тест-культури, є рослинами – медоносами.

Таким чином, з 127 видів рослин, антибактеріальна дія що до тест-культури Васillus subtilis УКМ В-90 була виявлена у 38 видів, з них у однієї городньої рослини, 15 – декоративних рослин, 22– дикорослих рослин. Такі рослини-медоноси, як м’яту перцеву, липу дрібнолисту, волошку лучну, вербозілля лучне можна рекомендувати для профілактики бактеріальних захворювань бджіл.

Література:

1. Evans JD, Schwarz RS. Bees brought to their knees: microbes affecting honey bee health // Trends Microbiol. – 2011. - 19(12): P.614-20.

2. Cornman RS, Tarpy DR, Chen Y, Jeffreys L, Lopez D, Pettis JS, vanEngelsdorp D, Evans JD. Pathogen webs in collapsing honey bee colonies // PLoS One. – 2012. -7(8).

3. Басовський І. Проблеми є завжди // український пасічник. – Львів: 2003. - № 9. – С. 34 – 36.

4.Бджільництво в Україні. Книжкова полиця http://beekeeping.com.ua/html/book_uk.html

5.Національний університет біоресурсів і природокористування України. Кафедра бджільництва ім.В.А. Нестерводського http://www.beeschool.kiev.ua

6. Інструкція щодо попередження та ліквідації хвороб і отруєнь бджіл. – К.: Державний департамент ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, 2001. – 82 с.

7. Bailey L., Ball B.V., Perry J.N. Association of viruses with protozoal pathogens of the honey bee. // Ann. Appl. Biol., 1983, Vol. 103. - P. 10 – 20.

8. Ball B.V. Acute Paralysis Virus isolated from honeybee colonies infected with Varroa jacobsoni. // J. Apic. Res., 1985. Vol. 24(2). - P. 115 – 119.

9. Cummins Joe. Neoniccotinoid insecticides used in seed dressing may be responsible for the collapse of honeybee colonies, April 24, 2007, http:// www.organicconsumers.org/articles/article_4972.cfm.

10. Louise A. Malone and Minh-Hà Pham-Delègue. Effects of transgene products on honey bees (Apis mellifera) and bumblebees (Bombus sp.), Apidologie, 32, 2001

11. Ramanujan K. Parasites, pathogens and pesticides called possible suspects in honeybee decimation, Cornell Chronicle, Cornell University, May 17, 2007, http://www.news.cornell.edu/Chronicle/07/05_17_07.pdf.

12. Genetic Survey Finds Association Between CCD and Virus,” September 2007, http://www.ars.usda.gov/is/pr/2007/070906.htm; and MAAREC statement, “Colony Collapse Disorder and Israeli Acute Paralysis Virus, ”http:// maarec.cas.psu.edu/CCDPpt/CCDbeekeepersStatementIAPV.pdf.

13. Кокорев Н.М., Чернов Б.Я. Болезни, вредители и хищники медоносных пчел. М.: Нива России, 2002. - 271 с.

14. Руденко Є.В. Комплексна система ветеринарно-санітарних заходів профілактики змішаних заразних хвороб бджіл на пасіках України // В. М. У. – К.: Обнова, 2003. - № 1. – С. 12 – 14

Науковий керівник:

кандидат біологічних наук Шепелевич Вікторія Володимирівна.