РНҚ ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ МЕХАНИЗМІ

Рнк интерференция ашылу тарихы

Бұдан жиырма жыл бұрын молекулярлы биология РНК-интерференция секілді таңғаларлықтай феноменді білмеген болатын. Қазіргі таңда бұл құбылыс барлық тірі ағзалардағы физиологиялық процестердің кең спектрінде қатысатындығы, ал олардың молекулярлық делдалдары-қысқа РНКлар –өздерінің әртүрлілігіне және арнайылылығы бойынша қан антиденелерінен қалмайтындығы анықталған. Қарапайымдыларда РНК-интерференция құбылсы иммунитетті қалыптастырады, көбінесе вирустардан қорғануды қамтамасыз етеді. Басқа салыстырмалы түрде дамыған ағзаларда бұл механизм тек сыртқы паразиттермен ғана емес, сонымен қатар ішкілерменде күресі үшін қосылады және гендердің белсенділігін реттеуші болып табылады. Қазіргі тағда мыңдаған қысқа реттеуші РНК-лар анықталған болатын, ал РНК-интерференция механизмі айтарлықтай дәрежеде зерттелді, дегенмен біз бұл айсбергтің ең биік шыңын ғана бақылап отырмыз. РНК-интерференция құбылысының ашылуы молекулярлы биология және генетика ғасырындағы ең негізгі жаңалықтардың бірі болып табылады, сонымен қатар бұл ашылудың маңызды бөлігі-жаңа фундаменталды механизмдер көмегі арқылы РНК молекулалары гендер экспрессиясына әсер ете алатындығы анықталды. Сонымен қатар, бұл әдіс гендер қызметін анықтау үшін лабораториялық әдіс ретінде, сонымен қатар адам геномын зерттеуде кеңінен қолданылып жатыр. Жақын болашқата РНК-интерференция принципіне негізделген тек қана нақты бір генге әсер ететін және онымен коделенетін ақуыз синтезін сөндіретін жаңа ұрпақтың дәрісі шығуы мүмкін. Бұндай РНК-интерференция нысана ретінде, мысалы, ісіктер жасушаларындағы белсенді гендер немесе вирустардың көбеюін қамтамасыз ететін гендер бола алады. Ең алғаш рет жаңалық 1998 жылдың ақпан айында жарық көрген болатын, яғни бұрын түсініксіз болған тәжірибелік зерттеу нәтижелерін Файер және Меллоу ең танымал генетикалық үлгі болып табылатын дөңгелек құрт Caenorhabditis elegans –қа зерттеу жүргзу арқылы «Nature» журналына мақала шығарып, түсіндірген болатын [1].

Осылайша, генетиктер петуня өсімдігінің одан да анық түсті түрін алу үшін олардың жасушаларына қызыл пигментке жауап беретін гендерді енгізген болатын. Қалымдардың таңғалысына орай, көптеген гүлдер қызыл түсті одан әрі күшейтудің орнына пигменттерін жоғалтты және ақ түске ие болды.

Кешірек Файер және Меллоу жұмыстарынан анық болғандай бұл парадокс негізде РНК интерференция құбылысы жатты. Басқада осыған ұқсас жаңдайларда тәжірибелік ағзаларда белсенділігі төмендеген жеке ДНК бөліктердің көшірмелері , яғни қысқа РНК көптеп пайда бола бастады. Қысқа РНК классына құрамында 20-дан 300-ге дейінгі нуклеотидтері бар молекулаларды айтады. РНК интерференция құбылысының эффектісіне небәрі 2128 нуклеотидтен тұратын ең қысқалары жауап береді. Бұл молекулалардың ерекшелігіне олардың көптеген жасушалық РНК-лар секілді тек қана бір тізбекті нуклеотидтер қатарынан емес, емес екі тізбекті РНК болуында. Екі тізбекті РНК тізбектерінің қарама-қарсы нуклеотидтері хромосомадағы екі тңзбекті ДНК секілді бір-бірімен байланысады. Шығу тегі белгісіз екі тізбекті РНК жасушаға түскенде соңғының жойылуы жүреді. Арнайы ақуыздар оны кішкентай бөліктерге бөледі, оны жасушамен пайда болған ферменттер жиынтығы қоршайды және ақпараттық РНК-ны бұзады.

Геннен берілетін белгі сөнеді, ақуыз шығарылмайды, ген өшеді. РНК интерференция процесі осылайша жүреді. Генетиктер тілінше оны екі тізбекті РНК болған жағдайдағы бір тізбекті ақпараттық РНК молеуласының арнайы дегредациясы деп атайды. Әлемдегі ең жоғарғы премия лауреаттары ббелгілі болды. «МГ»-да аталып өткендей, 2006 жылы физиология және медицина бойынша Нобель премиясы биомедициналық зерттеулер ғасырына жаңа баспалдақ салған екі американдық ғалым - 47 жасар Эндрю Файер (Массачутетс технологиялық институты) және 46 жасар Крейг Меллоуге (Массачутетс университетінің медициналық колледжі) берілген болатын.

Нобель лауреаттарымен ашылған жаңалық көптеген ағзаларда кеңінен таралған. РНК интерфренция құбылысының мүмкін түсіндірулердің біріне ағзаның РНК-лы вирустаран немесе РНК арқылы енетін мобильді элементтерден қорғануы болып табылады. Осылайша, екі тізбекті РНК бөтен РНК-ны танитын және ликвидациялайтын иммундық жүйенің маңызды звеносы болып табылады. Егерде жасушаға РНК-лы вирустар енетін болса, осындай қорғаныс жұйесі оның көбеюіне жол бермейді. Егер вирус құрамында ДНК болса, онда екі тәзбекті РНК-лар оған вирустық ақуыздарды түзуіне кері әсерін тигізеді. Жасушаны вирустардан және мобильді генетикалық элементтерден қорғаушы механизмді терапиялық мақсаттарға қолдануға болады [2].

РНК интерференцияның кілтті сатылары

Қалыпты жұмыс жасайтын жасушада әрбір ген өзіне ғана тиесілі қызметті атқарады, мысалы мРНК ақыздың синтезделуіне және оның басқада реттуші ақуыздармен байланысуына жауап береді. Бұнда жасушадағы геннің қалыпты экспрессиясы (от лат. expressus-анық) жайында айтылып отыр. Егер нақты бір геннің өнімі азайса, (мысалы, ақуыз) осы геннің экспрессиясының төмендегені болып табылады. Белгілі бір нақты гендер экспрессиясын қысқа РНК-лар арқылы "сөндіру " эффектісі РНК-интерференция деген атқа ие болды, ал оның пайда болуына әсерін тигізетін молекулалар siRNA (small interfering RiboNucleic Acids–қысқа интерферлеуші рибонуклеиндік қышқылдар) деп аталады. Bernstein басқа авторлармен бірге құрамында РНКаза III және dsRBD домендері бар дрозофиланың бірнеше ақуыздарының екі тәзбекті РНК-ның siRNA процессингіне қатысуының потенциальды мүмкіндіктерін зерттеді.

Экспрессиядан кейін тазартылған, құрамында РНКазаIII және dsRBD домендерінен басқа, РНК-хеликазды және PAZ-домендері бар E.coli ақуызы екі тізбекті РНК-ны 21-22 нуклеотидтен тұратын қысқа РНКларға ыдыраты алады, ал басқа ақуыздар қабілетке ие емес. Сәйкесінше бұл ген Dicer деп аталды (ағылшыннан қысқа бөліктерге бөлу). Dicer-ге қарсы алынған антиденелерді жасушасыз жүйелерге енгізу екі тізбекті РНК процессингіне қажетті белсенділікті ингибирлейді. Қазіргі таңда Dicer ақуызы екі доменінің біреуі арқылы екі тәзбекті РНК молекулаларының ұшын “заякорить” ететіндігі, ал 20-25 жұп нуклеотидтік арақашықтықта тұратын басқа домен екі тізбекті ДНК-нің екі тізбегінде де бөлінулер жасайтындығы анықталды. Осылайша, Dicer қысқа екі тізбекті РНК-ны берілген өлшеммен және нақты құрылымдық ерекшеліктермен қатесіз өлшейтін және белгілейтін “молекулярлы сызғыш ” секілді әсер етеді. Содан кейін Dicer қысқа РНК-ларды құрыманда Argonaute туысына кіретін ақуыздары бар жиынтыққа береді. Келесі кезеңде қысқа РНК дуплексінің айырылуы жүреді, олардың бір тізбегі жасушада өзіне комплементарлы РНК молекулаларын таниды, нәтижесінде Argonaute ақуызы олардың экспрессиясының катализдейді. Ақуызадардың “Argonaute” деп аталуының себебі: өсімдіктердегі сәйкес гендерде бірінші сипатталған мутациялар өсімдіктер жапырақтырының ерекше пішініне-арганавт жәндіктеріне ұқсас пішінге әкелді. “Argonaute” ақуыздары қысқа интерферлеуші РНК-ларды (siRNA) байланыстырады және siRNA фрагментіне комплементарлы байланысқан мРНК-ларға эндонуклеазалық белсенділікпен әсер етеді. РНК-ның Argonaute ақуыздарымен байланысуының молекулярлы механизмдері РНК-байланыстырушы доменнің рентгенқұрылымдық кристаллографиясы көмегімен жасалған болатын. РНК тізбектің фосфорлы 5' ұшы негізгі консервативті ұяшыққа түседі және екі валентті катиондар  (мысалы, Mg++) және siRNA-дағы 5' нуклеотидтер арасындығ ароматикалық стэкинг және тирозиннің консервативті қалдықтары арқылы байланыс түзеді.

Бұл сайт siRNA және оның мРНК нысанасымен байланысу үшін «нуклеация сайтын» түзеді. Эукариоттарда Argonaute ақуыздары мРНК бұзылулары жүретін цитоплазмалық денешіктер деген атпен белгілі жасушаның цитоплазмалық бөліктерінде жоғары концентрацияда идентифицирленген.

Argonaute ақуыздары микроРНКлардың белсенділігін реттеу және түзілуіне қатысады.

Сонымен, РНК-интерференцияның негізі жасуша цитоплазмасында циркулирленуші siRNA - қысқа екі тізбекті РНК-лардың ген құрылымы туралы ақпаратты тасымалдаушы бір тізбекті РНК молекулаларына қосылуы арқылы, оларды ингибирлеу жатыр. Қысқа РНК-лар класстарына 20-дан 300-ге дейінгі нуклеотдтік жиынтыққа ие молекулаларды жатқызады. РНК-интерференция эффектісіне небәрі 21-28 нуклеотидтен (сүтқоректілерде 21-23) тұратын ең қысқа siRNA жауап береді. siRNA эволюция жағынан ең ескісі және ол көбінесе өсімдіктерде біржасушалы ағзаларда және омыртқасыздарда кеңінен таралған.

Әртүрлі жасанды түрде синтезделген siRNA –ды дрозофиланың эмбриональды экстрактісіне қосу арқылы олардың белсенділігін өлшей отырып, авторлар келесідей жағдайларды көрсеткен:

• Белсенді дуплекстер 2 нуклеотидтен бастаушы 3'- ұштарға ие болуылары қажет;

• Осындай 3'-ұштарға ие болған жағдайда 21 нуклеотидтік siRNA-лар

салыстырмалы түрде белсенді болады; 24 және 25 нуклеотидтік өлшемдегі siRNA РНК-интерференцияның детектирлі эффектісін тудырмайды;

• siRNA-дың 3'- бастаушы ұшында дезоксинуклеотидтер болуы мүмкін, ол РНК-интерференция эффективтілігіне айтарлықтай дәрежеде әсер етпейді, толықтай алғанда бір siRNA тізбегінде 8 –ге дейін дезоксинуклеотидті қалдықтар болуы мүмкін, сондай - ақ ДНК-ның толықтай бір тізбегінің ауыстырылуы siRNA дуплексінің белсендірілілмеуіне алып келеді;

• siRNA –дың соңғы 3'-нуклеотидтік қалдығы РНК-нысананы тануда мағызды рөл атқармайды, дегенмен соңғының алды тануға қатысады;

- siRNA тізбектерінің және РНК-нысанның айтарлықтай дәрежеде сәйкес келмеуі РНК-интерференцияның бұзылуына алып келеді, соның ішінде siRNA-дің 3'-ұшы мен ортасында орналасқан ауысулар маңызды рөл атқарады [3].

РНК-нысанның ыдырау сайтына қарама-қарсы орналасқан бір ғана нуклеотидтің ауысуы siRNA-дың толықтай белсенсіз болуына әсерін тигізеді. Бұл молекулалардың ерекшелігі басқа жасушалық РНК секілді бір ғана нуклеотидтер тізбегінен емес, екі тізбектен тұрады. siRNA тізбектерінің қарама-қарсы нуклеотидтері бір-бірімен хромосомадағы екі тізбекті ДНК секілді байланысады. Сонымен қатар, siRNA-дің шеттерінде әрқашан байланыспаған нуклеотидтер қалады. Негізінен, siRNA жасушаны зақымдаған РНК негізінде синтезделеді, яғни антиделерге қарағанда олар нақты инфекция түріне «сәйкестендіріледі». Жасушадан тыс РНК-интерференция жұмыс жасамағанымен, ол жасушаішілік иммунитетті қанағаттандырарлықтай қамтамасыз етеді. Ең алдымен, siRNA зақымдалған ағзалардағы (мысалы, өсімдіктердегі киРНК осылай анықталған болатын) мРНК-ны немесе немесе геномды РНК-ны жою арқылы антивирусты иммунитет қалыптастырады. Вирусті РНК-ны енгізу вирусты РНК-ның молекулалық затравкасының негізінде арнайы siRNA-дың амплификациясын тудырады. Сонымен қатар, siRNA әртүрлі млбильді генетикалық элементтердің (МГЭ) экспрессиясын бәсеңдетеді, ал ол эндогенді «инфекциялардан» қорғануды қамтамасыз етеді. RISC-жиынтығындағы гендер мутациясы МГЭ-нің жоғары белсенділігі әсерінен геномның тұрақсыздығының жоғарлауына алып келеді; siRNA өздерінің гендерінің гиперэкспрессиясына жауап ретінде сол өдерінің гендерінің шектеушісі болады. Гендер жұмысын реттеу тек қана трансляция деңгейінде ғана емес, сонымен қатар транскрипция кезінде – Н3 гистоны бойынша гендерді метилирлеу арқылы жүреді. Алғашқы 4 деңгей барлық ағзаларға ортақ болып табылады. Алдымен siRNA молеклаларымен хеликаза және нуклеазалар ақуыз-ферменттері байланысады (1 кезең), RISC жиынтығы (RNA-induced silencing complex; silence - ағыл. сөйлемеу; silencing – тыныштық, арнайы және ағылшын әдебиетінде генді «өшіру» процесі осылай аталады) пайда болады. Хеликаза siRNA жіпшелерін ажыратады, нәтижесінде олар ажырайды ( 2 кезең ). Арнайы аты арганавт болып табылатын нуклеза ферменті байланысқан жіпшелердің біреуі бір тізбекті мРНК –ның комплементарлы (нақты сәйкес келетін) бөлігімен байланыса отырып, нуклеазаларға оларды кесуга рұқсат береді (3 кезең), кесілген мРНК бөліктері басқа да жасушалық РНК-аз әсерлеріне түсіп, одан да кішкентай бөліктерге бөлінеді ( 4 кезең ).

РНК-интерференция механизмінің жалпы үлгісі екі негізгі кезеңдерден тұрады деп ұсынылады: бірінші кезеңде екі тізбекті РНК-ның қысқа 21-23 нуклеотидті РНК-ға айналу процессингі жүреді, екінші кезеңде siRNA ақуыздармен бірге гомологиялық мРНК-ны таниды және оны дегредацияға ұшыратады [4].

Әбедиеттер тізімі:

1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.

2. Deleris, A., Gallego-Bartolome, J., Bao, J., Kasschau, K. D., Carrington, J. C., and Voinnet, O. (2006) Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science 313, 68-71.

3. Ding, S. W., and Voinnet, O. (2007) Antiviral immunity directed by small RNAs. Cell 130, 413-426.

4. Moissiard, G., Parizotto, E. A., Himber, C., and Voinnet, O. (2007) Transitivity in Arabidopsis can be primed, requires the redundant action of the antiviral Dicer-like 4 and Dicer-like 2, and is compromised by viral-encoded suppressor proteins. RNA 13, 1268-1278.