МЕТОДИЧНІ ПІДХОДИ ДО РОЗКРИТТЯ ЛАТЕНТНОЇ АРГІНАЗНОЇ АКТИВНОСТІ ЛІМФОЦИТІВ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ ДОНОРІВ І ХВОРИХ НА РЕВМАТИЧНІ ЗАХВОРЮВАННЯ

Вивчення змін ензиматичної активності аргінази – одного з ключових ензимів метаболізму оксиду азоту (NO) дає інформативну оцінку про перебіг патологічних змін в організмі, зокрема, при ревматичних захворюваннях та викликає значний інтерес у дослідників в медико-біологічній практиці.

Аргіназа – ензим, який каталізує гідролітичне розщеплення L-аргініну до сечовини і L-орнітину. Відомо, що аргіназа модулює імунну відповідь. Вважають, що висока експресія аргінази свідчить про гуморальну відповідь зі сторони імунної системи на антиген.

Відомо, що під дією великої кількості зовнішніх і внутрішніх факторів процес активації імунокомпетентних клітин може закінчуватися реалізацією або “позитивної” (продукція цитокінів, проліферація), або “негативної” (апоптоз, анергія) відповіді [1, 2].

Так, розвиток хронічного запалення в синовіальній оболонці при артритах пов’язаний з активацією і проліферацією імунокомпетентних клітин, супроводжується виділенням клітинних медіаторів запалення, синтезом антицитрулінових й інших антитіл, формуванням імунних комплексів. Ці процеси ведуть до розростання сполучної тканини в синовіальній оболонці, виділення протеолітичних ензимів, активації циклооксигенази-2 з підвищенням синтезу простагландинів, що супроводжується розвитком запальної реакції, в результаті чого виникає деструкція кісткової тканини суглобів [3].

В результаті проведених нами попередніх досліджень по вивченню активності аргінази в лімфоцитах периферичної крові (ЛПК) показано [4], що у хворих на ревматоїдний артрит (РА) та анкілозивний спондилоартрит (АСА) аргіназна активність істотно відрізняється від групи здорових осіб. Після проведеного курсу лікування значення активності ензиму у хворих дещо наближається до її контрольних значень.

З огляду на те, що аргіназа – ензим мітохондріальної локалізації, для розкриття її латентної активності доцільною є пермеабілізація клітинних мембран. Тому для визначення активності даного ензиму у ЛПК ми використовували такий пермеабілізуючий агент як сапонін. Сапонін належить до групи речовин амфіфільної природи, що здатні зв’язуватися з мембранними білками гідрофобними зв’язками, одночасно взаємодіючи полярними групами з водою [5]. Це дає змогу молекулам детергенту розпушувати мембрану, водночас не порушуючи структури і функцій транспортувальних систем.

Метою даної роботи є підбір оптимальної концентрації сапоніну для дослідження аргіназної активності ЛПК донорів і хворих на РА та АСА.

Дослідження проводили на ЛПК донорів та хворих, які перебували на стаціонарному лікуванні у ревматичному відділенні Львівської обласної клінічної лікарні. Групу контролю становили практично (клінічно) здорові донори, репрезентативні за віком та статтю.

Моноядерні ЛПК людини виділяли з гепаринізованої свіжоотриманої венозної крові хворих і донорів у градієнті густини фікол-тріумбрасту [6]. Цілісність і життєздатність лімфоцитів, яка в усіх дослідах становила не менше 95%, оцінювали за забарвленням трипановим синім [7].

Для пермеабілізації мембран ЛПК та розкриття активності аргінази до суспензії лімфоцитів додавали сапонін в діапазоні концентрацій від 0,02 до 0,3 %. Дана методика грунтується на роботах, виконаних на лімфоцитах раніше [8]. Вміст білка у лімфоцитарній суміші визначали методом Лоурі [9]. Визначення ензиматичної активності аргінази ЛПК проводили за утворенням сечовини, вміст якої визначали за допомогою діагностичного набору відповідно до інструкції фірми-виробника (Simko, Україна).

Активність аргінази визначали спектрофотометрично при 520 нм, реєструючи процес утворення сечовини. Кількість продукту реакції, що утворився в процесі ензиматичної реакції, визначали згідно з інструкцією і виражали у нмоль сечовини/хвмг загального протеїну у пробі [10].

Виявлено, що низькі концентрації сапоніну (0,02-0,04%) є недостатніми для розкриття латентної активності досліджуваного ензиму. Так як аргіназа є мітохондріальним ензимом, для її активації необхідна дещо більша кількість сапоніну.

Залежність аргіназної активності лімфоцитів ЛПК від концентрації сапоніну ( M  m, n = 4)

З рисунка видно, що у широкому діапазоні концентрацій детергенту (0,02-0,3%) крива залежності ензиматичної активності від концентрації сапоніну куполоподібна: максимальне значення активності спостерігається за концентрації 0,2-0,3 %.

Таким чином, саме цей діапазон концентрацій детергенту слід вважати найоптимальнішим для практичного використання в експериментах з вивчення кінетичних та каталітичних властивостей реакції аргінази. В разі використання в експериментах 0,02-0,04 % сапоніну відбувається пригнічення аргіназної активності, що становить різницю в 4,2 рази порівняно з її максимальним значенням.

Дослідження залежності активності ензимів від концентрації сапоніну проводились іншими дослідниками, де було показано схожі концентрації сапоніну для розкриття латентної активності як мембранозв’язаних так і цитозольних ензимів [11].

Отже, нами було виявлено оптимальну концентрацію сапоніну для визначення аргіназної ензиматичної активності ЛПК. Досліджено, що залежність активності аргінази сапонін-перфорованих ЛПК донорів та хворих на РА та АСА носить однаковий характер.

Література:

1. Mueller D.L. Molecular mechanisms underlying functional T-cell unresponsiveness / D.L. Mueller, M.K. Jenkins // Curr. Opin. Immunol. – 1995. – Vol. 7. – P. 375-381.

2. Swain S.L. The activation and differentiation of T cells / S.L. Swain // Immunologist. - 1995. - V. 3, № 5/6. – P. 209-211.

3. Детская ревматология: Руководство для врачей / Под ред. А.А. Баранова, Л.К. Баженовой. – М.: Медицина, 2002. – С. 336

4. Личковська Н.Е. Активність аргінази в лімфоцитах периферичної крові у хворих на ревматоїдний артрит та анкілозивний спондилоартрит / Н.Е. Личковська, Р.В. Фафула, У.П. Єфремова, З.Д. Воробець // Світ біології та медицини. – 2010. – № 2. – С. 125-129.

5. Болдырев А.А. Введение в биомембранологию / А.А. Болдырев // М.: Изд.-во МГУ. 1990. – 208 с.

6. Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood / A. Boyum // Scand. J. Clin. Lab. Invest. – 1968. – V. 21, N. 97. – P. 77-79.

7. Mishell B. B. Selected Methods in Cellular Immunology / B.B. Mishell, S.M. Shiigi, W. H. Freeman et al. // San Francisko. – 1980. – 486 p.

8. Кімакович О.В. Фармакологічна активність квамателу та функціонування іон-транспортуючих систем у лімфоцитах крові / О.В. Кімакович, Н.О. Підковка, З.Д. Воробець // Практична меди­цина. – 2004. – Т. 10, № 2. – С. 86-89.

9. Lowry O. H. Protein measurement with the Folin phenolreagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr et al. // J. Biol. Chem. – 1951. – V. 193. – P. 265-275.

10. Шугалей В.С. Содержание мочевины и активность аргиназы в органах крыс при акклиматизации к холоду / В.С. Шугалей, А.С. Козина // Физиол. журн. СССР. – 1977. – № 8. – C. 1199-1202.

11. Підковка Н.О. Дослідження деяких властивостей АТФ-аз у лімфоцитах крові людини / Н.О. Підковка, З.Д. Воробець, А.Б. Зіменковський // Експ. та клін. фізіол. та біохімія. – 2002. – Т. 7, № 1. – С. 38-41.

 

Науковий керівник: д.б.н., проф. Воробець Зіновій Дмитрович