КІНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ Na+, K+-ATР-ази ЛІМФОЦИТІВ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ ХВОРИХ НА РЕВМАТОЇДНИЙ АРТРИТ ТА АНКІЛОЗИВНИЙ СПОНДИЛОАРТРИТ

На сьогодні проблема ревматичних захворювань надзвичайно актуальна. Ревматоїдний артрит (РА) – найбільш поширене запальне аутоімунне захворювання, яке має високі показники поширеності і призводить до ранньої втрати працездатності та зменшення тривалості життя. Анкілозивний спондилоартрит (АСА) – ревматичне захворювання невідомої етіології, в основі якого лежить системна дезорганізація сполучної тканини на фоні виражених аутоімунних змін в організмі.

Найбільшу увагу дослідників привертають лімфоцити, які є ключовими клітинами імунної системи, і в кооперації з іншими видами лейкоцитів, відіграють важливу роль у забезпеченні компенсаторно-пристосувальних реакцій організму [1]. Йонний гомеостаз є важливим показником функціональної активності лімфоцитів периферичної крові (ЛПК). Він забезпечується суперпозицією різних йон-транспортувальних систем клітини, серед яких важлива роль належить Na⁺, K⁺-ATР-азі.

Na⁺, K⁺-АТР-аза (ЕС 3.6.1.37) – маркерний ензим плазматичної мембрани і селективно інгібується оуабаїном, є Са²⁺-незалежною, Na⁺, K⁺-активованою, Mg²⁺, АТР-залежною транспортувальною системою, що здійснює активне трансмембранне перенесення йонів Na⁺ та K⁺, і тим самим підтримує їх електрохімічні градієнти, необхідні для нормального функціонування клітини. Багаточисленними дослідженнями показано, що активність Na⁺, K⁺-АТР-ази, яка відіграє ключову роль у підтриманні внутрішньоклітинного йонного гомеостазу, осмотичного балансу клітини, трансмембранного потенціалу клітин, регуляції апоптозу, розмноження і диференціювання клітини і змінюється під впливом гормонів, факторів росту і стресу [2].

Метою представленої роботи э вивчення кінетичних властивостей Na⁺, K⁺-ATР-ази сапонін-перфорованих ЛПК донорів та хворих на РА і АСА залежно концентрації йонів Mg²⁺ .

Дослідження проводили на ЛПК донорів та хворих на РА та АСА на момент поступлення у ревматичне відділення Львівської ОКЛ. Групу контролю становили практично (клінічно) здорові донори, репрезентативні за віком і статтю.

Моноядерні ЛПК людини виділяли з гепаринізованої свіжоотриманої крові донорів і хворих на РА та АСА у градієнті густини фікол-тріумбрасту [3]. Цілісність і життєздатність ЛПК, яка в усіх дослідах становила не менше 95%, оцінювали за забарвленням трипановим синім [4]. Для пермеабілізації мембран ЛПК та розкриття латентної Nа⁺, К⁺-АТР-азної активності до суспензії лімфоцитів додавали 0,2 % сапонін.

Активність Na⁺, K⁺-АТР-ази сапонін-перфорованих ЛПК визначали спектрофотометрично, реєструючи утворення Pi за методом W. Rathbun, V. Betlach [5] і визначали за різницею між величиною загальної і базальної АТР-азної активності у присутності оуабаїну.

Дослідження впливу концентрації йонів Mg²⁺ на Na⁺, K⁺-ATР-азну активність сапонін-перфорованих ЛПК донорів та хворих на РА і АСА проводили в діапазоні концентрацій MgCl₂ від 0 до 7 мМ.

Уявні кінетичні параметри, які характеризують Na⁺, K⁺-активовану, Mg²⁺-залежну АТР-гідролазну реакцію – константу активації йонами Mg²⁺ та початкову максимальну швидкість реакції гідролізу АТР за Mg²⁺ визначали за методом Лайнуівера-Берка [6].

Відомо, що крім субстрату, яким виступає АТФ, для функціонування Na⁺, K⁺-ATР-ази необхідними є йони магнію. Йони Mg²⁺ виступають кофактором і утворюють хелатний комплекс MgАТР, який є субстратом ензиматичної реакції. Також, Mg²⁺ взаємодіє з фосфатними групами АТР, поляризує їх, і таким чином полегшує нуклеофільну атаку на термінальний -фосфат.

Графік залежності оуабаїнчутливої Na⁺, K⁺-ATР-азної активності ЛПК донорів від вмісту йонів Mg²⁺ в інкубаційному середовищі має типовий куполоподібний вигляд. Як видно з рисунка, максимальне значення оуабаїнчутливої Na⁺, K⁺-ATР-ази спостерігається при 5 мМ MgCl₂. Графіки залежності Na⁺, K⁺-ATР-азної активності сапонін-перфорованих ЛПК хворих на РА та АСА мають схожий вигляд.

Рис. Концентраційна залежність впливу йонів Mg²⁺ на активність оуабаїнчутливої Na⁺, K⁺-ATР-ази сапонін-перфорованих лімфоцитів периферичної крові практично здорових донорів, M  m n = 4.

Шляхом лінеаризації цієї концентраційної залежності у координатах Лайнуівера-Берка встановлено, що початкова максимальна швидкість гідролізу АТР сапонін-перфорованих ЛПК, визначена за йонами Mg²⁺ та уявна константа активації йонами Mg²⁺ у хворих на РА та АСА достовірно не відрізняються від практично здорових донорів.

Виявлено, що за умов розвитку ревматичної патології Mg²⁺-зв’язувальна ділянка оуабаїнчутливої Na⁺, K⁺-ATФази ЛПК хворих на РА та АСА залишається нативною.

Література:

1. Гжегоцький М.Р. Система крові. Фізіологічні та клінічні основи / М.Р. Гжегоцький, О.С. Заячківська // Львів: Світ, 2001. – С. 173.

2. Кравцов А.В. Механизмы регуляции векторных ферментов биомембран / А. В. Кравцов, И. Р. Алексеенко // К.: Наук. думка, 1990. – С. 176.

3. Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood / A. Boyum // Scand. J. Clin. Lab. Invest. – 1968. – V. 21 (Supp. 97). – P. 77–79.

4. Mishell B.B. Selected Methods in Cellular Immunology / B.B. Mishell, S.M. Shiigi // San Francisko: W. H. Freeman and Company. – 1980. – P. 486.

5. Rathbun W. Estimation of enzymically produced orthophosphate in the presence of cysteine and adenosine triphosphate / W. Rathbun, V. Betlach // Anal. Biochem. – 1969. – V. 28. – P. 436–447.

6. Келети Т. // Основы ферментативной кинетики: Пер. с англ. / Т. Келети // М: Мир, 1990. – 350 с.

Науковий керівник: д.б.н., проф. Воробець Зіновій Дмитрович