Окисление липидов и состав мембран хрусталика крыс в процессе старения

Введение. В настоящее время роль активных форм кислорода (АФК) в биохимических и физиологических процессах оценивается двойственно. С одной стороны, АФК рассматриваются как негативные агенты, инициирующие неконтролируемые процессы свободнорадикального окисления, что может приводить к необратимой дисфункции клеточных структур, преждевременному старению и гибели клеток [1]. Тем не менее, в ходе последних двух десятилетий выявлена существенная роль АФК в процессе пролиферации клеток [2,3]. Наряду с этим, в настоящее время исследуются изменения липидного состава волокон хрусталика, которые могут играть важную роль в функциональной активности мембран и влиять на восприимчивость белков хрусталика к повреждающему действию продуктов липопероксидации [4,5]. Таким образом, целью настоящей работы явилось изучение связи липидного состава мембран и интенсивности свободнорадикальных процессов в ткани хрусталика крыс в процессе постнатального развития.

Материалы и методы. Эксперименты проведены на крысах самцах линии Wistar трёх возрастных групп: 1 месяц (n=20), 12 месяцев (n=16), и 24 месяца (n=20) при продолжительности жизни крыс 30–40 месяцев. Хрусталики гомогенизировали на льду в стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:25 (масса хрусталика к объему раствора). Гомогенат использовался при дальнейшем анализе. Спектрофотометрические и спектрофлуориметрические измерения выполнены с использованием прибора «Флюорат 02 Панорама» (С.-Петербург 2009).

Экстракцию и очистку липидов из анализируемого материала проводили методом Folch [6]. Уровень общих липидов определяли с помощью набора «Bio-Test Total Lipids» (PLIVA-Lachema, Чехия). Содержание диеновых конъюгатов и сопряжённых кетодиенов оценивали спектрофотометрически [7]. Уровень ТБК-активных продуктов, соответствующих, содержанию малонового диальдегида (МДА) оценивали спектрофотометрически [8]. Оценку уровня α-токоферола и ретинола проводили спектофлюориметрически [9,10]. Уровень всех параметров, относили к количеству липидов и выражали в нмоль/мг липидов (для ТБК-активных комплексов) или в относительных единицах. Для хроматографического анализа использовались пластины марки Sorbfil (Краснодар, Россия). Система растворителей для разделения липидных классов - хлороформ : метанол: вода : гептан - 65 : 25 : 4 : 9 [11]. Визуализацию зон липидов проводили обработкой пластин 10% раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле с последующим инкубированием при 120°С в течение 10 минут. Количественная обработка хроматограмм выполнена с использованием программы NIH ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Статистическая обработка данных выполнена с помощью программы Statistica 6.0. Оценку межгрупповых различий проводили с использованием дисперсионного анализа ANOVA с post-hoc поправкой Бонферрони. Данные представлены в виде <среднее ± стандартная ошибка среднего>. Выборки считались принадлежащими к разным генеральным совокупностям при р<0,05 [12].

Результаты и обсуждение. Уровень первичных продуктов ПОЛ - диеновых и триеновых конъюгатов – статистически значимо увеличивался от 1 к 12 месяцам и уменьшался приблизительно вдвое от 12 к 24 месяцам (рис 1). В то же время, концентрация ТБК-активных комплексов, соответствующих малоновому диальдегиду, продукту, образующемуся на промежуточных стадиях ПОЛ, снижалась в ходе постнатального развития: 1 мес. – 23,31±1,62; 12 мес. – 18,94±2,34; 24 мес. – 15,14±2 нмоль/мг липидов. Различия между группами 1 и 24 мес. были статистически значимы.

Рис.1. Уровень диеновых конъюгатов (ДК), сопряжённых кетодиенов/триеновых конъюгатов (ТК) в ткани хрусталика крыс. Различия между всеми группами статистически значимы.

Изменения уровня α-токоферола между группами были незначительны, тогда как уровень ретинола был снижен у группы 24 месяца по сравнению с остальными (табл.1). Таким образом, можно предположить, что липофильные антиоксиданты α-токоферол и ретинол, в малой степени влияют на интенсивность процессов свободно-радикального окисления.

Основные компоненты фосфолипидной составляющей мембран хрусталиков представлены в табл.1. Выраженными чертами возрастной динамики липидного состава явились увеличение доли сфингомиелинов, снижение доли фосфатидилэтаноламинов и повышение относительного содержания нейтральных липидов.

Преобладание начальных продуктов липопероксидации (ДК, ТК) в хрусталиках крыс младших возрастных групп может быть обусловлено активностью мембранной НАДФН-оксидазы. Данный ферментный комплекс участвует в передаче сигнала с рецепторов факторов роста [13,14], и продуцируемые НАДФН-оксидазой АФК являются промежуточным звеном реализации сигнальных каскадов, ответственных за пролиферацию [15]. В связи с этим можно предположить значительный вклад мембранной НАДФН-оксидазы в генерацию продуктов ПОЛ у крыс возраста 1 месяца. В связи с тем, что процесс дифференцировки контролируется теми же ростовыми факторами, можно так же предположить весомую роль НАДФН-оксидазы в интенсификации перекисного окисления липидов хрусталика у крыс возраста 12 месяцев.

Таблица 1.

Уровень липофильных антиоксидантов и основных липидных классов мембран хрусталика крыс.

СМ – сфингомиелины, ФХ – фосфатидилхолины, ФЭ – фосфатидилэтаноламины, Фл – фосфолипиды, Нл – нейтральные липиды; ** - статистические значимые различия между всеми группами, * - статистические значимые отличия группы 24 мес. от остальных, # - статистические значимые различия между группами 1 и 24 мес.

В связи с равномерным уменьшением концентрации ТБК-активных комплексов в ряду 1-12-24 месяца можно предположить, что продукция малонового диальдегида специфическим образом связана с активностью митохондрий клеток эпителия и слабо-дифференцированных волокон хрусталика, снижающейся в процессе старения.

Повышение с возрастом доли сфингомиелинов и нейтральных липидов в целом объясняется увеличением доли зрелых волокон, составляющих ядро хрусталика, по сравнению со слабо- и умеренно- дифференцированными волокнами и клетками эпителия. Такой молекулярный состав мембран зрелых волокон обеспечивает их относительную физическую и химическую стабильность, в частности жёсткость и устойчивость к пероксидации. Показано, что сфингомиелины и холестерин эффективно препятствуют процессам латерального транспорта кислорода по мембранам и окисления ненасыщенных жирных кислот в составе фосфолипидов [16,17]. Таким образом, повышение уровня сфингомиелинов и нейтральных липидов может являться прямой причиной снижения интенсивности свободно-радикальных процессов на мембранах клеток хрусталика, что отражается в снижении уровня диеновых и триеновых конъюгатов у группы 24 мес.

Заключение. В ходе исследования наблюдалась динамика накопления продуктов ПОЛ, антиоксидантов и изменения липидного состава в хрусталиках крыс в ходе постанатального развития. Отмечено более высокое содержание диеновых конъюгатов и сопряжённых кетодиенов в возрасте 1 и 12 месяцев по сравнению с возрастом 24 месяца. Концентрация ТБК-активных комплексов с возрастом равномерно снижалась. Полученные результаты позволяют предположить, что обогащение мембран сфингомиелином и нейтральными липидами ингибирует свободно-радикальные процессы, тогда как присутствие липофильных антиоксидантов имеет незначительный эффект.

Литература.

1. Harman D. Free-radical theory of aging: increasing the functional life span. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1994. 717, 257-266.

2. Sundaresan M., Yu Z.X., Ferrans V.J., Irani K., Finkel T. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. 1995;270:296-299.

3. Burdon R.H. Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation. Free. Radic. Biol. Med. 1995;18:775-794.

4. Grami V., Marrero Y., Huang L., Tang D., Yappert M.C., Borchman D. α-Crystallin binding in vitro to clear human lenses. Exp. Eye Res. 2005. 81, 138-146.

5. Yappert M.C., Borchman D. Sphingolipids in human lens membranes: an update on their composition and possible biological implications. Chem. Phys. Lipids. 2004:129, 1-20.

6. Folch P.J., Lees M., Stanley G. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue. J. Biol. Chem. 1957. 226, 497-509.

7. Shenstone F.S. Ultraviolet and visible spectroscopy of lipids.-N.Y.-1971.p.77-93.

8. Smith J.B., Ingerman CM. Lab. Clin. Med. 1976. 88: 167 - 172.

9. Hewavitharana A.K., Lanari M.C., Becu C. Journal of Chromatography A. 2004; 1025(2): 313-317

10. Parrish D.B., Moffitt R.A., Noel R.J., Thompson JN(1985) In:J. Augustin B.P., Klein D.A., Beckery P.B. (Eds.), Methods of Vitamin Assay. John Wiley and Sons, New York, pp153.

11. Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. В 2-х ч. Ч.2. Пер. со словац. М.:Мир, 1980, с.536-540.

12. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М.,Практика, 1998. 459 С.

13. Wang Y., Lou M.F. The regulation of NADPH oxidase and its assotiation with cell proliferation in human lens epithelial cells. IOVS. 2009;50:2291-2300.

14. Lovicu F.J., McAvoy J.W., De Iongh R.U. Understanding the role of growth factors in embryonic development: insights from the lens. Phil. Trans. R. Soc. B. 2011. 366: 1204-1218.

15. Chen K.C., Zhou Y., Xing K., Krysan K., Lou M.F. Platelet-derived growth factor (PDGF)-induced reactive oxygen species in the lens epithrlial cells: the redox signalling. Exp. Eye Res. 2004; 78: 1057-1067.

16. Raguz M., Widomska J., Dillon J., Gaillard E.R., Subczynski W.K. Characterization of lipid domains in reconstituted porcine lens membranes using EPR spin-labeling approaches. Biochim. Biophys. Acta. 2008. 1778, 1079-1090.

17. Oborina E.M., Yappert M.C. Effect of sphingomyelin versus dipalmitoyl-phosphatidylcholine on the extent of lipid oxidation. 2003. Chem. Phys. Lipids. 123, 223–232.

Научный руководитель: д.б.н., зав.лаб. физико-химических исследований НИИ ПФМ НижГМА Росздрава Иванова И.П.