Иммуноцитологические показатели крови зеленых лягушек, обитающих в озерах урбанизированной территории

Для определения степени воздействия антропогенного загрязнения используют методы биоиндикации с оценкой морфологических, гематологических, цитогенетических и иммунологических характеристик состояния живых организмов [4]. Амфибии характеризуются вполне развитой кроветворной и иммунной системами, отражающими любые функциональные изменения, происходящие в процессе жизнедеятельности животного[9]. Существенный вклад в методы в биоиндикации вносят исследования иммуногематологической системы, четко реагирующей на внешние раздражители и обладающей высокой степенью клеточного обновления.

Целью работы являлась оценка иммуноцитологических показателей крови зеленых лягушек рода Rana, обитающих в качественно разных условиях среды.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Оценка качества среды по стабильности развития зеленых лягушек по уровню флуктуирующей асимметрии билатеральных признаков. 2. Дифференцированный подсчет клеток костного мозга миелоидного и эритроидного рядов дифференцировки зеленых лягушек. 3. Анализ лейкоцитарной формулы периферической крови зеленых лягушек, обитающих в качественно разных условиях среды. 4. Дифференцированный подсчет видов микроядер в эритроцитах периферической крови зеленых лягушек.

Объектом исследования являлись зеленые лягушки рода Rana: озерная (Rana ridibunda P.) и прудовая (Rana lessonae C.) (75 особей), собранные в трёх экспериментальных точках: точка 1 – оз. Свято (Нижегородская обл., Арзамасский район); точка 2 – оз. Вторчермет (г. Н. Новгород, Канавинский район); точка 3 – озеро, расположенное на территории очистных сооружений (г. Н. Новгород, Нижегородский район). Степень отклонения качества среды от нормы определяли по нарушению стабильности развития амфибий и оценивали по пятибалльной шкале [6]. Для оценки цитогенетического гомеостаза использовали микроядерный тест [3]. Лейкоцитарную формулу и подсчет клеток костного мозга миелоидного и эритроидного рядов дифференцировки проводили по окрашенным мазкам костного мозга общепринятым методом [5]. Для обработки экспериментальных данных использовали пакет прикладных программ Statistica V.8.0 [8]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью непараметрических критериев (Крускала-Уоллиса и Манна-Уитни). За величину статистической значимости принимали р = 0,05.

Как известно, амфибии являются связующим звеном между водными и наземными экосистемами и состояние их организма отражает качество локального местообитания [1,8]. Мерой стабильности развития живых организмов является величина флуктуирующей асимметрии (ФА), под которой понимают незначительные ненаправленные отклонения от строгой билатеральной симметрии [4]. Оценка состояния зеленых лягушек по флуктуирующей асимметрии выявила возрастание нестабильности развития амфибий. Так, величина ФА популяции амфибий, обитающих в оз. Свято (точка 1) составляла (0,30±0,02), что соответствовало I баллу качества среды (условно нормальное). Популяция зеленых лягушек, обитающая в оз. Вторчермет (точка 2) характеризовалась более высокой величиной ФА – (0,60±0,02), соответствующей IV баллу качества среды (существенные отклонения от нормы). В точке 3 отмечена самая большая величина ФА – (0,70±0,02), что соответствовало V баллу (критическое состояние).

Центральным гемопоэтическим органом является красный костный мозг. В нем находится основная часть стволовых кроветворных клеток, происходит их созревание и дифференцировка. Костный мозг отвечает на изменения условий среды усилением или ослаблением кроветворных процессов. После созревания оформленные клетки из костного мозга поступают в кровоток.

У исследованных популяций амфибий было установлено возрастание количества промиелоцитов в 4,4 раза (Z_1-2=2,24; p=0,02) и полихроматофильных нормоцитов в 1,6 раза (Z_1-2=2,72; p=0,006) в выборке из популяции лягушек точки 2 (оз. Вторчермет, IV балл качества среды) по отношению к условно – контрольной точке (точка 1, оз. Свято, I балл качества среды). Полученный результат может свидетельствовать об усилении пролиферативных процессов кроветворных клеток, что вызвано необходимостью усиления метаболизма организма при постоянном обитании животных в условиях повышенного загрязнения среды (рис. 1).

Известно, что периферическая кровь, одна из самых реактивных клеточных систем организма, и соотношение маркерных показателей лейкоцитарной формулы позволяет определить тип адаптационной реакции организма к различным воздействиям среды. Показано, что наиболее значительными сдвигами в процентном содержании характеризовались нейтрофильные и базофильные гранулоциты. При этом характер реакции белой крови в условиях воздействия комплекса антропогенных факторов определялся возрастанием пресса нагрузки на среду обитания. При существенных отклонениях от нормы (IV балл качества среды, оз. Вторчермет, точка 2) выявлен сдвиг лейкоцитарной формулы вправо, что проявлялось в увеличении числа моноцитов и статистически значимом снижении числа гранулоцитов: палочкоядерных нейтрофилов и базофильных гранулоцитов (рис.2). При V балле качества среды (Точка 3, озеро, расположенное на территории очистных сооружений) выявлен сдвиг лейкоцитарной формулы влево за счет увеличения доли миелоцитов, юных форм нейтрофильных и базофильных гранулоцитов, на фоне снижения числа лимфоцитов (рис.3). Такой характер лейкограммы, свидетельствовал о стрессовой реакции земноводных, вызванной, по-видимому, действием комплекса неблагоприятных факторов, в том числе различных химических веществ (солей тяжелых металлов, пестицидов и др.).

Большинство загрязнителей среды являются ксенобиотиками и мутагенами, под воздействием которых эритроциты крови способны образовывать внутри себя особые ядерные структуры - микроядра. Различают три вида микроядер: стандартные, прикрепленные и неоформленный ядерный материал. Наличие в клетках периферической крови микроядер стандартного вида, является естественным [2], тогда как присутствие в клетках микроядер других видов является результатом различных цитогенетических нарушений [10].

Соотношение видов микроядер в крови зеленых лягушек, обитающих в условиях IV балла и V балла качества среды (точка 2 и 3), существенно отличалось от особей контрольного водоема. В периферической крови лягушек этих популяций выявлено снижение доли стандартных микроядер, на 69% у особей точки 2 и на 72% у особей, обитающих в точке 3. У особей этих популяций в эритроцитах периферической крови преобладали клетки с микроядрами прикрепленного вида (рис. 4), наличие которых свидетельствовало о нарушениях цитогенетического гомеостаза и связано с нарушениями в структуре хромосом, вызванными мутагенными факторами окружающей среды [10]. Кроме того, отмечено уменьшение доли неоформленных микроядер в эритроцитах лягушек, обитающих в точке 3.

Полученные результаты свидетельствуют о существенных изменениях, происходящих в крови животных, подверженных воздействию урбанизации и загрязнения, и указывают на эколого-генетическое неблагополучие среды обитания.

Литература:

1. Большаков В.Н. Специфика формирования видовых сообществ животных в техногенных и урбанизированных ландшафтах/ Большаков В.Н., Пястолова О.А., Вершинин В.Л. // Экология. – 2001. – №5. – С.343 – 354.

2. Гелашвили Д. Б. Оценка степени симметрии тест-организмов в биомониторинге наземных и водных экосистем / Гелашвили Д.Б., Чупрунов Е.В., Радаев А.А. // Международная научная конференция «Малые реки: современное экологическое состояние, актуальные проблемы». Тольятти, 2001. – С.7-11.

3. Жулева Л. Ю. Использование микроядерного теста для оценки экологической обстановки в районах Астраханской области / Жулева Л.Ю., Дубинин Н.П. // Генетика. – 1994. – Т. 30. – №7. – С.999– 1004.

4. Захаров В. М. Здоровье среды: Методика оценки / Захаров В.М. , Баранов А.С., Борисов В.И. – М.: Центр экологической политики России, 2000. – 68с.

5. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике/. Меньшиков В.В, Делекторская Л.Н. , Золотницкая Р.П и др.– М.: Медицина, 1987. – 368 с.

6. Методические рекомендации по выполнению оценки качества среды по состоянию живых существ (оценка стабильности развития живых организмов по уровню асимметрии морфологических структур). М., 2003. – 24с.

7. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / Реброва О.Ю. – М.: Медиа Сфера, 2008. – 306с.

8. Чубинишвили А.Т. Морфогенетическая и цитогенетическая характеристики природных популяций зеленых лягушек гибридогенного комплекса Rana esculenta в естественных условиях и подверженных антропогенному воздействию: Автореф. дис…канд. биол. наук. / Чубинишвили А.Т. – М.,1997.

9. Manning M.J. RES structure and function of the Amphibian the reticuloendothelial system: A comprehensive treatise/ Manning M.J., Horton J.D. // Eds. Cohen N.I. – Plenum Press. New York, London, 1982.– Vol. 3. – 393 p.

10. Sawada S. Chromosome aberration, micronuclei and sister-chromatide exchanges (SCEs) in rat liver induced in vivo by hepato-carcinogenes including heterocyclic amides / Sawada S., Yamanaka T. , Yamatsu K.et al. // Mutat.Res.1991.V.251. №1.P.59-69.